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Title (eng)
Recovery of Listeria monocytogenes genotypes in challenge tests
Author
Jessica Khadka
Assessor
Tom Grunert
Degree supervisor
Beatrix Stessl
Description (eng)
Bachelor thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Abstract (eng)
Listeria monocytogenes (LMO), a gram-positive zoonotic pathogen that can be transmitted through contaminated food. L. monocytogenes is further subdivided into clonal complexes (CC) and sequence types (ST). LMO strains have adapted to different niches and show growth in different environments such as soil, plants, water, food matrices and food processing facilities. According to EC Regulation 2073/2005 on the food safety criterion of LMOs, food products are classified according to whether LMO growth is possible. Therefore, for products that support growth, there is an additional requirement that L. monocytogenes must not be detectable before the product is placed on the market and must not exceed the limit of 100 cfu/g during shelf life. Mandatory measures to detect the presence and growth of L. monocytogenes include food lot testing, environmental monitoring and challenge testing to estimate the growth potential of L. monocytogenes in different food matrices. The aim of this study was to estimate the growth potential of L. monocytogenes in lettuce samples in collaboration with a private laboratory. An accredited private laboratory prepared the samples for challenge testing and sent the selective agar plates according to ISO 11290-2 for further subtyping. We prepared a strain cocktail of different LMO field isolates (ST121, ST21, ST2) with the reference strain (ST145) available for inoculation of the products. The aim was to determine the potential growth advantage of individual persistent LMO strains over others. Two types of ready-to-eat (RTE) salads were tested for quantitative analysis. Three experiments were performed with the inoculated lettuce samples on days 0, 4, 6 and 8 at three dilutions (1:3, 1:30 and 1:300) at 6°C and 8°C. Experiment 1 was the challenge test with a RTE mixed green salad and experiments 2 and 3 with a monoproduct salad. Reference samples and corresponding success control samples were prepared in triplicates for each sample group. PCR was performed targeting the abcZ, bglA, cat, dapE, dat, IhkA and ldh alleles, which were sent to LGC Genomics for sequencing. The sequencing results were uploaded to the Multi Locus Sequence Typing (MLST) Institute Pasteur database to determine the CC and ST. The results confirmed the hypothesis that the in-house persistent isolates had a growth advantage over the reference strain (ST145). ST121 and ST21 showed a clear growth advantage in all three experiments. There was limited or no detection of ST2 and ST145 in experiments 1 and 2. The results of experiment 3 suggest that the virulent ST2 and the other strains ST121 and ST21 outcompeted each other, explaining the overall reduced recovery of the strains. The inoculation method can be improved in future studies to achieve the target inoculum detection limit of 100 CFU/g. An important factor to consider in challenge testing is the individual plant microbiome, which can influence LMO growth and recovery.
Description (deu)
Bachelorarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Abstract (deu)
Listeria monocytogenes (LMO), ein gram-positiver Zoonoseerreger, der durch kontaminierte Lebensmittel übertragen werden kann. L. monocytogenes wird weiter in klonale Komplexe (CC) und Sequenztypen (ST) unterteilt. LMO-Stämme haben sich an verschiedene Nischen angepasst und wachsen in unterschiedlichen Umgebungen wie Boden, Pflanzen, Wasser, Lebensmittelmatrizen und Lebensmittelverarbeitungsanlagen. Gemäß der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über das Kriterium der Lebensmittelsicherheit von LMOs werden Lebensmittel danach klassifiziert, ob ein LMO-Wachstum möglich ist. Daher gilt für Produkte, die ein Wachstum unterstützen, die zusätzliche Anforderung, dass L. monocytogenes nicht nachweisbar sein darf, bevor das Produkt in Verkehr gebracht wird, und dass der Grenzwert von 100 cfu/g während der Haltbarkeitsdauer nicht überschritten werden darf. Maßnahmen zum Nachweisen des Vorhandenseins und Wachstums von L. monocytogenes gehören die Untersuchung von Lebensmittelpartien, die Umweltüberwachung und Challenge-Tests zur Abschätzung des Wachstumspotenzials von L. monocytogenes in verschiedenen Lebensmittelmatrizen. Ziel dieser Studie war es, das Wachstumspotenzial von L. monocytogenes in Salatproben in Zusammenarbeit mit einem privaten Labor zu ermitteln. Ein akkreditiertes privates Labor bereitete die Proben für Challenge-Tests vor und schickte die selektiven Agarplatten gemäß ISO 11290-2 zur weiteren Subtypisierung ein. Wir bereiteten einen Stammcocktail aus verschiedenen LMO-Feldisolaten (ST121, ST21, ST2) vor, wobei der Referenzstamm (ST145) für die Inokulation der Produkte zur Verfügung stand. Ziel war es, den potenziellen Wachstumsvorteil einzelner persistenter LMO-Stämme gegenüber anderen zu ermitteln. Zwei Arten von verzehrfertigen Feldsalaten wurden für die quantitative Analyse getestet. Drei Experimente wurden mit den geimpften Salatproben an den Tagen 0, 4, 6 und 8 in drei Verdünnungen (1:3, 1:30 und 1:300) bei 6°C und 8°C durchgeführt. Versuch 1 war der Challenge-Test mit einem gemischten RTE-Salat und die Versuche 2 und 3 mit einem Monoproduktsalat. Referenzproben und entsprechende Erfolgskontrollproben wurden in dreifacher Ausfertigung für jede Probengruppe hergestellt. Es wurde eine PCR für die Allele abcZ, bglA, cat, dapE, dat, IhkA und ldh durchgeführt, die zur Sequenzierung an LGC Genomics geschickt wurden. Die Sequenzierungsergebnisse wurden in die Multi Locus Sequence Typing (MLST)-Datenbank des Institute Pasteur hochgeladen, um die CC und ST zu bestimmen. Die Ergebnisse bestätigten die Hypothese, dass die hauseigenen persistenten Isolate einen Wachstumsvorteil gegenüber dem Referenzstamm (ST145) hatten. ST121 und ST21 zeigten in allen drei Versuchen einen deutlichen Wachstumsvorteil. ST2 und ST145 wurden in den Versuchen 1 und 2 nur begrenzt oder gar nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse von Versuch 3 deuten darauf hin, dass sich der virulente ST2 und die anderen Stämme ST121 und ST21 gegenseitig verdrängt haben, was die insgesamt geringere Erholung der Stämme erklärt. Die Inokulationsmethode kann in künftigen Studien verbessert werden, um die angestrebte Inokulum -Nachweisgrenze von 100 KBE/g zu erreichen.Ein wichtiger Faktor, der bei Challenge-Tests zu berücksichtigen ist, ist das individuelle Pflanzenmikrobiom, das das Wachstum und die Erholung von LMO beeinflussen kann.
Type (eng)
Bachelor theses
Language
[eng]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4700
AC number
AC17679502
Number of pages
38
Date issued
2023
License
All rights reserved