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Title (eng)
Modelling KMT2A::MLLT3-driven leukemia in human induced pluripotent stem cells
Author
Edwin Rzepa
Degree supervisor
Sabine Strehl
Degree supervisor
Klaus Fortschegger
Degree supervisor
Florian Grebien
Description (eng)
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2023
Abstract (eng)
Pediatric acute myeloid leukemia (AML) is a rare subtype of leukemia, which is characterized by uncontrolled proliferation and blocked differentiation of myeloid progenitors. This malignancy is mainly caused by chromosomal rearrangements, which lead to the expression of oncogenic fusion proteins driving leukemogenesis. KMT2A rearrangements are found in about 20% of AML patients and are generally associated with an inferior outcome. One of the most frequent fusion genes, KMT2A::MLLT3, results from a t(9;11)(p22;q23) translocation and is often accompanied by secondary mutations in the RAS signaling pathway. Although several downstream targets of the KMT2A::MLLT3 fusion protein are already well-known, it is still poorly understood at what stage of hematopoietic development and how this fusion drives malignant transformation. As patient material only captures the late stage of full-blown leukemia and mouse models do not fully reflect human disease, innovative model systems faithfully recapitulating leukemia development are required. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) offer a promising alternative to other model systems since they can be used to address both the early stages of leukemia development and disease progression. Based on previous studies showing that expression of leukemia-associated fusion oncoproteins in hiPSCs upon their in vitro differentiation into hematopoietic progenitors gives rise to leukemia-like cells resembling the human disease, we hypothesized that this system may also be utilized to accurately model KMT2A::MLLT3-driven leukemia. The aim of this study was to apply genome editing technologies to generate hiPSC lines harboring the KMT2A::MLLT3 fusion and/or the RAS pathway-activating NRAS G12D mutation. We have successfully generated the respective hiPSC clones and subsequently in vitro differentiated them toward hematopoietic stem and progenitor cells. Assessment of their clonogenic potential by colony formation assays revealed strongly increased self-renewal of KMT2A::MLLT3-expressing progenitors compared to hiPSC carrying only the NRAS G12D mutation and wild-type hiPSCs. Notably, through the expression of KMT2A::MLLT3 fusion protein, hematopoietic progenitors were maintainable in long-term liquid cultures, and outgrowth was further exacerbated by the additional NRAS-activating mutation indicating cellular transformation. Taken together, we have established an hiPSC-based KMT2A::MLLT3-driven leukemia model, which has the potential to recapitulate leukemia development.
Description (deu)
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2023
Abstract (deu)
Die pädiatrische akute myeloische Leukämie (AML) ist eine seltene Unterform der Leukämie, die durch unkontrollierte Proliferation und blockierte Differenzierung von myeloischen Vorläuferzellen charakterisiert ist. Diese bösartige Erkrankung wird hauptsächlich durch chromosomale Alterationen verursacht, die zur Expression von onkogenen Fusionsproteinen führen, welche für die Entstehung der Leukämie verantwortlich sind. Chromosomale Umstrukturierungen des KMT2A Gens werden bei etwa 20 % der AML-Patienten gefunden und sind im Allgemeinen mit einem eher ungünstigen Krankheitsverlauf verbunden. Eines der häufigsten Fusionsgene, KMT2A::MLLT3, resultiert aus einer t(9;11)(p22;q23)-Translokation und wird oft von sekundären Mutationen im RAS-Signalweg begleitet. Obwohl einige durch KMT2A::MLLT3 regulierte Signalwege bereits bekannt sind, ist immer noch unzureichend geklärt, in welchem Stadium der hämatopoetischen Entwicklung und wie dieses Fusionprotein die maligne Transformation der Zellen antreibt. Da Patientenmaterial nur das Spätstadium der bereits vollständig entwickelten Leukämie abbildet und Mausmodelle die Krebserkrankung des Menschen nicht vollständig widerspiegeln, werden innovative Modellsysteme benötigt, welche die Leukämieentwicklung präzise reproduzieren. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSZ) bieten eine vielversprechende Alternative zu anderen Modellsystemen, da sie dazu verwendet werden können, sowohl die frühen Stadien der Leukämieentwicklung als auch das Fortschreiten der Erkrankung zu untersuchen. Aufgrund früherer Studien, in denen gezeigt wurde, dass die Expression von Leukämie-assoziierten Fusionsonkoproteinen in hiPSZ, nach ihrer in vitro Differenzierung in hämatopoetische Vorläuferzellen zur Bildung von Leukämie-ähnlichen Zellen führt, die der menschlichen Krankheit ähneln, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass dieses System auch für die Modellierung der von KMT2A::MLLT3-getriebenen Leukämie verwendet werden kann. Ziel dieser Studie war, mittels Genomeditierung hiPSZ-Linien herzustellen, welche die KMT2A::MLLT3-Fusion und/oder eine den RAS-Signalweg aktivierende Mutation tragen. Wir haben die entsprechenden hiPSZ-Klone erfolgreich generiert und sie anschließend in vitro in hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen differenziert. Die Bewertung ihres klonogenen Potenzials durch Koloniebildungstests zeigte eine deutlich erhöhte Selbsterneuerung von KMT2A::MLLT3-exprimierenden Vorläuferzellen im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Zellen oder solchen, die nur eine NRAS G12D-Mutation tragen. Bemerkenswert ist, dass durch die Expression des KMT2A::MLLT3-Fusionsproteins das Wachstum der hämatopoetischen Vorläuferzellen in Flüssigkulturen langfristige aufrechterhalten werden konnte und durch die zusätzliche NRAS-aktivierende Mutation noch beschleunigt wurde, was auf eine zelluläre Transformation hinweist. Zusammenfassend haben wir ein hiPSZ-basiertes KMT2A::MLLT3-getriebenes Leukämiemodell etabliert, welches das Potenzial hat, die Leukämieentwicklung im Reagenzglas zu rekapitulieren.
Type (eng)
Master theses
Language
[eng]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4116
AC number
AC17420560
Number of pages
131
Date issued
2023
License
All rights reserved