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Title (eng)
From DNA methylation to protein
Selection and evaluation of regulated targets in a human cerebral ischemia in vitro model of the blood-brain barrier
Author
Barbora Valentová
Assessor
Ralf Steinborn
Degree supervisor
Sabine Lagger
Degree supervisor
Winfried Neuhaus
Description (eng)
Master thesis - University of Veterinary Medicine Vienna - 2021
Abstract (eng)
Background: Stroke and traumatic brain injury (TBI) are two threatening disorders of the central nervous system (CNS) that in case of survival usually result in serious permanent disabilities. Course of both diseases is accompanied by cerebral ischemia. The blood-brain barrier (BBB) represents a neuroprotective border formed by brain capillary endothelial cells. Loss of the BBB integrity is a consequence of cerebral ischemia. Recent studies demonstrated that the restorative processes initiated at the BBB after cerebral ischemia are regulated by epigenetic mechanisms, namely DNA methylation. The aim of this study was to evaluate the effect of oxygen-glucose deprivation (OGD) on the expression and function of targets selected from DNA methylation arrays of OGD treated human cerebral microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3). Methods: Targets were chosen based on Kegg Pathway Database, Gene Set Enrichment Analysis, and STRING database analysis. Their expression was examined at mRNA and protein level. For analysis at mRNA level, RNA samples from different conditions were used: hCMEC/D3 in co-culture with astrocytes and pericytes, hiPS-EC in co-culture with astrocytes and pericytes, and human TBI biopsy samples. For analysis at protein level, hCMEC/D3 mono-culture was exposed to OGD at 0.1% oxygen for 5 hours followed by recovery phase for additional 19 hours. For inhibitor studies, transwell models with hCMEC/D3 cells in co-culture with glioma C6 cells were subjected to 5-hour OGD treatment at 0.1% oxygen. Results: Selected 13 regulated targets showed significant changes at mRNA level as well as at protein level in different experimental set-ups after two distinct OGD timepoints. Data analysis of qPCRs with human TBI biopsy samples from four patients revealed changes in the expression of DNA methylation targets over the time. Inhibitor studies performed with SGK1 inhibitor demonstrated greater damage and injury to the BBB when applied at higher concentrations, while displayed powerful protective response upon the cells in lower concentrations. Conclusion: Epigenetics, namely DNA methylation, emerges as a valuable tool for understanding complex processes arising at the BBB during and after cerebral ischemia. Identification and characterization of novel DNA methylation targets may help to tackle currently restricted treatment strategies as well as to develop means of restoring permanent damage resulting from stroke and TBI in case of survival.
Description (deu)
Masterarbeit - Veterinärmedizinische Universität Wien - 2021
Abstract (deu)
Hintergrund: Schlaganfall und Schädel-Hirn Trauma (SHT) sind zwei bedrohliche Erkrankungen des Zentralnervensystems, die im Falle des Überlebens normalerweise zu schweren und dauerhaften Behinderungen führen. Beide Krankheiten werden von zerebraler Ischämie begleitet. Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine neuroprotektive Grenze dar, die durch Hirnkapillarendothelzellen gebildet wird. Der Verlust der BHS-Integrität ist eine Folge der zerebralen Ischämie. Jüngste Studien zeigten, dass die an der BHS nach zerebraler Ischämie initiierten restaurativen Prozesse von epigenetischen Mechanismen, nämlich DNA-Methylierung, reguliert sind. Ziel dieser Studie war es, den Effekt die Wirkung von Sauerstoff- und Glukoseentzug (SGE) auf die Expression und die Funktion der Ziele aus DNA-Methylierungsanordnungen der SGE-behandelten menschlichen, geistigen, mikrovaskulären Endothelzelllinie hCMEC/D3 auszuwerten. Methoden: Die Ziele wurden basierend auf der KEGG-Pathway-Datenbank, der Gene-Set-Anreicherungsanalyse und der String-Datenbankanalyse ausgewählt. Ihre Expression wurde auf mRNA- und Eiweißebene untersucht. Für die Analyse auf mRNA-Ebene wurden RNA-Proben verschiedener Zustände verwendet: hCMEC/D3 in der Co-Kultur mit Astrozyten und Perizyten, hiPS-EC in Co-Kultur mit Astrozyten und Perizyten sowie Human-TBI-Biopsie-Proben. Bei der Analyse des Proteinspiegels wurde die hCMEC/D3-Monokultur für 5 Stunden SGE mit Sauerstoff von 0,1% ausgesetzt, gefolgt von einer Erholungsphase für weitere 19 Stunden. Bei Inhibitorstudien wurden Transwell-Modelle mit hCMEC/D3-Zellen in der Co-Kultur mit Gliom-C6-Zellen einer 5-stündigen SGE Behandlung mit 0,1% Sauerstoff unterzogen. Ergebnisse: 13 ausgewählte regulierte Ziele zeigten erhebliche Veränderungen auf mRNA-Ebene sowie Veränderungen des Proteinspiegels in verschiedenen experimentellen Setups nach zwei unterschiedlichen SGE-Zeitpunkten. Die Datenanalyse von qPCRs mit humanen TBI-Biopsie-Proben von vier Patienten ergab Änderungen der Expression der DNA-Methylierungsziele über die Zeit. Inhibitorstudien, die mit SGK1-Inhibitor durchgeführt wurden, zeigten größere Beschädigungen und Verletzungen der BHS bei höheren Konzentrationen, während die Zellen in niedrigeren Konzentrationen eine leistungsstarke Schutzreaktion anzeigten. Schlussfolgerung: Epigenetik, nämlich DNA-Methylierung, ist ein wertvolles Werkzeug, um komplexe Prozesse zu verstehen, die während und nach der zerebralen Ischämie auf der BHS ablaufen. Die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger DNA-Methylierungsziele kann dazu beitragen, die derzeit eingeschränkten Behandlungsstrategien zu verbessern und dauerhafte Schäden zu bewältigen, welche sich aus Schlaganfall und SHT ergeben.
Type (eng)
Master theses
Language
[eng]
Persistent identifier
https://phaidra.vetmeduni.ac.at/o:4079
AC number
AC16668996
Number of pages
197
Date issued
2021
License
All rights reserved